独家秘籍！空间转录组样本准备指南 | 空间转录组专题

通过先前的介绍相信大家对空间转录组的原理、研究方法等都有了初步的了解--小白必看！带你走进空间转录组、破案！空间转录组的前世今生你get了吗？，那么对于我们来说想要做空间转录组测序需做哪些准备工作？这些准备工作又应该如何开展？注意事项有哪些呢？下面让我们一起来看看吧!

     样本准备流程

取样

将新鲜的组织样本分为两份（一份用于抽提 RNA检测样品质量，一份用于冷冻切片进行空间转录组实验），将两份样本分别切成长×宽≤6.5mm×6.5mm、8mm≤高度≤12mm的组织块（其中6.5mm×6.5mm为切片横截面面积），用实验专用吸水纸擦干表面（防止冰晶的形成）。 

注：如样本较难获取，可制备一份样本，但此样本的高度尽量达到12mm，以保证足够用于质检和正式实验。

样本冷冻包埋

方法一：新鲜组织包埋向样本中加入包埋液

在组织包埋盒中滴入少量OCT组织包埋液（聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂），再将上述修剪好的组织块放在组织包埋盒中，再加入OCT组织包埋液没过组织块，如下图1。

图1 OCT包埋液中的组织

注：

• OCT组织包埋液需湿冰或4°冰箱预冷≥30min
  

• 包埋过程中加入包埋液时要尽量避免产生气泡

速冻

速冻方法一：异戊烷速冻

如下图2，在金属器皿中放入2/3体积的异戊烷，再将金属器皿放在液氮中提前预冷。

图2 装有异戊烷的金属器皿在液氮中预冷

注：

• 提前预冷异戊烷，但预冷时间过长会出现结冰情 况，需要在结冰前拿出

• 液氮/干冰：干冰用研钵和杵敲碎为干冰粉

• 医用手术刀、镊子：使用前需干冰预冷≥30min

用医用镊子将组织包埋盒放在上述预冷的异戊烷中（如下图3），将装有异戊烷的金属容器放入液氮中冷冻1-2min直至包埋剂变硬变白。包埋后，对组织进行 Trimming，将多余的部分去掉，留下需要的组织块。

图3 异戊烷速冻包埋

注：速冻时将包埋盒下方接触异戊烷，避免异戊烷接触到未凝固的包埋剂

速冻方法二：干冰速冻

将组织包埋盒放在干冰上速冻3~5min直至包埋剂变硬变白(如下图4) 。

图4 干冰速冻包埋后的组织

注：

• 在干冰盒中放入足够的干冰，尽量将干冰敲碎成干冰粉，使得组织包埋盒受冷均匀

• 由于干冰速冻操作更加简便，所以同等条件下优先选择干冰速冻的方法

保存

包埋后的组织固定到包埋盒中，在包埋盒上标记好样品名称，转入自封袋内标记好，随打印好的样品提交单一起寄出。如暂不送样，先保存在- 80℃冰箱中。

方法二：新鲜组织冻存后包埋速冻

在金属器皿中放入2/3体积的异戊烷，再将金属器皿放在液氮中提前预冷。

用医用镊子将组织放入上述预冷的异戊烷中，并将金属容器放入液氮中冷冻1~2min至完全冷冻，迅速将组织转移到提前在干冰中预冷的低温冷冻管中（如图5）。

图5 组织冷冻过程（左），冷冻组织放入冻存管（右）

保存

同方法一

冷冻组织包埋

可将上述冷冻样本从-80℃冰箱取出后放在干冰上，然后按照方法一的1、2流程完成样本包埋工作。

注：

两种方式操作过程中均需要快速处理，避免组织长期置于常温下，同时避免反复冻融操作，目的是防止组织形态改变和RNA降解。

冷冻包埋方法不仅仅局限于上述两种方式，其他方法可以咨询评估，样本质检合格，也可用于尝试进行空间转录组实验

SMALL RED FLOWER你问我答提问：

空间转录组主要可以应用于哪些领域呢？

联川生物

现多应用于医学相关的研究方向，如病理、肿瘤、神经、免疫和生长发育等

提问：

想做空间转录组，哪些样本可以做呢？

联川生物

目前10x官方已经测试的样本类型：

人类：脑、乳房、心脏、肾脏、大肠、肺、淋巴、卵巢、脊髓、脾脏等

小鼠：脑，眼、舌、心脏、肾脏、小肠和大肠、肝脏、肺、嗅球、卵巢、四头肌、脾脏、胃、睾丸、胸腺和甲状腺等

大鼠：脑、心脏、肾脏和嗅球等

斑马鱼：幼体

具体信息可以查询10x Genomics官网：https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/tissue-optimization/doc/specifications-visium-spatial-gene-expression-optimized-tissues

提问：

只有新鲜组织可以做空间转录组吗？FFPE可以做吗？

联川生物

可以的！10x Genomics全新的Visium 福尔马林固定石蜡包埋样本（FFPE）空间基因表达解决方案，可以突破过去从FFPE组织中获取空间全转录组基因表达信息的障碍。通过对整张组织切片进行分析，来消除需要预先选择感兴趣区域的相关方法带来的局限，以免错过重要的生物学信息。通过优化的空间FFPE全转录组方案，我们能够从FFPE样本中以高灵敏度和高特异性分析相关基因的表达，在形态学背景下实现真正的探索发现。

提问：

为什么用异戊烷速冻？可以直接用液氮速冻吗？

联川生物

异戊烷是必需的，组织直接放入液氮后会沸腾，在组织周围产生气穴，导致组织降温过程中不同区域降温不同，改变组织内部形态甚至碎裂，影响组织切片效果。

提问：

样本冷冻包埋方法一和方法二有什么区别，适用场景分别是什么？

联川生物

新鲜组织取样后如可立即进行包埋处理的则优先选择对新鲜组织进行包埋的处理方式，如果取样后暂无法进行包埋操作则先将组织进行冻存，-80℃冰箱先保存，后面再进行组织包埋处理。

运输至公司

将样品从冻存环境中取出，放入壁厚且质量完好的泡沫盒中，样品的上下和四周都用干冰填满，将泡沫盒子封好后邮寄。

注：

• 24小时内能够到达的，干冰重量不得低于5kg；48小时内能够到达的，干冰重量不得低于10kg；72小时内能够到达的，干冰重量不得低于15kg

• 运输过程中包埋样本切勿冻融

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